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烟叶叶黄素降解菌发酵条件

[导读]探讨烟叶中叶黄素生物降解的方法,利用单因素试验和响应面分析法对叶黄素降解酶高产菌株Ewingella americana( Y32) 的液体发酵工艺条件进行优化。

  叶黄素是一类含氧类胡萝卜素的总称,是重要的香料前体物,其降解物种类、含量直接决定着烟叶的品质。因此,对叶黄素及相关影响因素的研究在国内外烟草行业是一个热点。新鲜烟叶中叶黄素的构成为叶黄质60%、新黄质22%、紫黄质18%。叶黄素的降解产物能显著提高烟叶品质。根据双键断裂的部位不同,叶黄素能降解产生很多致香物质,如大马酮、紫罗兰酮等。这些香味物质阈值相对较低、刺激性较小、香气质较好、对烟叶香气贡献率大,是影响烟叶香气质和香气量的重要组分。在烟丝中加入0. 02% 叶黄素后,其香气、杂气、刺激性都有所增加,余味变差。香气增加可能是由于叶黄素热裂解产生了氧化异佛尔酮、巨豆三烯酮等物质,而杂气、刺激性明显增加可能与叶黄素热解时产生的大量苯及其同系物有关。因此,若能在加工期间通过某种技术降解烟叶中的叶黄素,将有利于卷烟减害及其抽吸品质的提高。国内关于叶黄素降解的研究主要集中于物理降解( 热裂解) 、化学降解、氧化降解,对其生物降解研究尚少。与传统物理降解、化学降解相比较,生物降解叶黄素有以下2 个方面的显著优点: 首先生物降解利用了酶催化的专一性,可得到成分相对单一的香味物质; 其次,生物降解得到的香味物质被认定为“天然成分”。因此,利用生物法降解叶黄素受到研究人员越来越多的关注。河南省烟草工业生物技术重点实验室从烟叶中筛选到叶黄素降解酶高产菌Ewingella americana( Y32) ,本研究综合考虑

碳源、氮源、无机盐的影响,采用单因素试验和响应面法对该叶黄素降解菌的发酵培养基进行优化,以期为其在卷烟加工和调香方面的应用提供理论

依据。

材料和方法

材料与仪器

供试菌株: 美洲爱文氏菌( Ewingella americana)由河南省烟草工业生物技术重点实验室筛选得到并保存。

培养基: 液体种子培养基( 葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母膏0. 5%、NaCl 0. 1%,pH 值6. 0) 、基础发酵培养基( 葡萄糖1%、蛋白胨5%、酵母膏5%、MgSO4 0. 01%、叶黄素0. 01 g、Tween - 80 1. 0 mL、

蒸馏水1 L,pH 值6. 0) 。主要仪器: LC - MS 联用仪( 美国赛默飞世尔公司) 、HF Mega BE - C18 柱( 美国安捷伦科技公司) 、高速冷冻离心机( 德国Herolab 公司) 、单人双面净化工作台( 苏州净化设备有限公司) 、精密电子天平( 赛多利斯科学仪器( 北京) 有限公司) 、溶剂微孔过滤膜有机系( 天津津腾实验设备有限公司) 、50 L 立式圆形压力蒸汽灭菌锅( 上海医用核子仪器厂) 、pH酸度计( 上海市实验仪器总厂) 。

试验方法

   培养方法种子培养: 挑取单菌落,接种于液体种子培养基中, 28 ℃、150 r /min 避光培养24 h,即为种子液。发酵培养: 按2% 的接种量将种子液接种于基础发酵培养基中, 28 ℃、150 r /min 避光培养96 h。

叶黄素降解率的测定

   发酵液预处理将发酵液在避光条件下12 000 r /min 离心10 min,取上清液,加入等体积二氯甲烷反复萃取3 次,得叶黄素的提取物,加无水Na2SO4干燥过夜,过0. 45 μm 的有机系膜,以备LC -MS 分析,并以等体积不接菌培养基作为对照。

   LC - MS 分析条件液相条件: 选择Thermo C18柱,常温,进样压力化学电离源( APCI) 作为离子源; 毛细管加热温度: 350 ℃; 电喷雾电压:5 kV; 离子源鞘气( N2) : 30 L /min; 离子源辅助气( N2) : 10 L/min; 碰撞气体为高纯氦气( > 99. 999%) ;扫描范围: 200 ~ 2 000 m/z 全扫描; 扫描速率: 1 scan /s。

  内标配制用苏丹红Ⅰ号作为内标。准确称取0. 020 96 g 的苏丹红Ⅰ号,用二氯甲烷定容至500 mL 作为内标液备用。

  叶黄素标准曲线的绘制准确称取0. 010 15 g的叶黄素标准样品,用上述内标液定容至30 mL。再分别用移液管准确量取0. 1、0. 5、1. 0、3. 0、5. 0、7. 0、10. 0 mL 的标准样品溶液,用内标液定容至10 mL。根据建立的色谱条件进行LC - MS分析后,以标样峰面积( Ai) /内标峰面积( As) 为纵坐标( Y) 、质量浓度为横坐标( X) ,绘制标准曲线。

  叶黄素降解率计算计算公式: 叶黄素降解率= ( c试验× V试验) /( c对照× V对照) × 100%,式中,c—叶黄素质量浓度( mg /mL) ,V—发酵液体积( L) 。叶黄素降解条件的单因素试验

  培养基中碳源的优化在每100 mL 基础发酵培养基中接种2% 的种子液,分别以1% 的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、糊精、壳聚糖作为碳源,在28 ℃、150 r /min 条件下发酵培养96 h,通过LC -MS 法测定叶黄素含量,计算叶黄素降解率,优选出合适的碳源。再设置碳源添加量分别为0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%、3. 0%、4. 0%、5. 0%进行发酵,对其添加量进行优化。

  培养基中氮源的优化在每100 mL 基础发酵培养基中接种2% 的种子液,分别以1% 的蛋白胨、酵母膏、NH4NO3、KNO3、( NH4)2SO4、天门冬酰胺作为氮源进行发酵,优选出合适的氮源。再设置氮源添加量分别为0. 1%、0. 25%、0. 5%、0. 75%、1%、1. 5%、2%进行发酵,对其添加量进行优化。

  培养基中无机盐的优化在每100 mL 基础发酵培养基中接种2% 的种子液,在以上最优条件确定的情况下,分别添加0. 1% 的CaCl2、KCl、MgSO4、KH2PO4、NaCl、FeSO4、Na2SO4进行发酵,优选出合适的无机盐。再设置添加量分别为0. 01%、0. 05%、0. 10%、0. 15%、0. 20%、0. 25%、0. 30% 进行发酵,对其添加量进行优化。

  响应面法确定最佳培养降解条件通过

  单因素试验,确定Box - Behnken 试验各因素的水平,设葡萄糖、酵母膏、KH2PO4添加量3 个因素,每个因素设3 个水平,进行摇瓶发酵试验,寻找最佳发酵培养基成分。








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